PCR - Phản ứng chuỗi trùng hợp


1. PCR là gì?
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (tạm dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp nhờ polymerase. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, chẩn đoán bệnh, tách dòng gene, xác định huyết thống v.v.

2. Nguyên tắc và quy trình
PCR là một kỹ thuật cho phép khuyếch đại nhanh một mẩu DNA cụ thể trong ống nghiệm (hơn là trong các tế bào sống như là E. coli). Với quy trình này người ta có thể tạo ra vô số bản sao của một phân tử DNA đơn. Quy trình "tạo dòng in vitro" này được tóm tắt như sau:

phản ững chuỗi trùng hợp - pcr

- Để thực hiện một PCR, cần phải biết ít nhất một đoạn trình tự của phân tử DNA quan tâm (ví dụ một mẩu máu).

 -  Sau đó phải tổng hợp các đoạn mồi (primer), tức các  oligonucleotide ngắn (chứa khoảng hai chục nucleotide) mà nó bổ sung chính xác với trình tự ở đầu 3' của mỗi một sợi của DNA cần khuyếch đại. 

 -  Mẩu DNA được đun nóng để tách các sợi đơn (biến tính) và trộn lẫn với các đoạn mồi. 

 -  Nếu như các  đoạn mồi tìm thấy các trình tự bổ sung trong DNA, chúng sẽ kết hợp vào các sợi đó.

 -  Sự tổng hợp bắt đầu (bao giờ cũng theo chiều 5' → 3') bằng cách sử dụng sợi gốc làm khuôn. 

 -  Hỗn hợp phản  ứng phải chứa  tất cả bốn loại deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và một DNA polymerase (loại chịu nhiệt, ví dụ  Taq polymerase  được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng). 

 -  Sự trùng hợp cứ tiếp diễn chừng nào mỗi sợi đơn được tổng hợp mới còn chứa đủ vị trí được nhận biết bởi đoạn mồi khác. 

 - Lúc này ta có hai phân tử DNA giống hệt phân tử ban đầu. 

 - Bây giờ ta lấy hai phân tử này cho biến tính và lặp lại quá trình đó. 

- Sau mỗi chu kỳ số phân tử DNA lại tăng gấp đôi. 
Nhờ sử dụng các thiết bị tự động, mỗi chu kỳ tái bản có thể hoàn thành chưa  đầy 5 phút. Sau 30 chu kỳ, từ một phân tử DNA ban  đầu  được khuyếch  đại lên hơn một tỷ bản sao (230 = 1,02 x 109). Như vậy, về nguyên tắc, với phương pháp PCR ta có thể khuyếch đại đủ số DNA từ một chân tóc hay một giọt máu để xác định trình tự DNA. 

3. Sự phát triển và mở rộng các ứng dụng gần đây của PCR
Từ khi ra đời đến nay, phương pháp PCR đóng vai trò cách mạng hoá trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau như: chẩn đoán nhanh, giải trình tự DNA bộ gene, gây đột biến điểm định hướng, v.v. Có thể thực hiện PCR in situ (ngay trong tế bào) với cả DNA và RNA.
Do phương pháp PCR  đơn giản, dễ thực hiện và có nhiều ứng dụng rộng rãi nên nó được hoàn thiện không ngừng. Thật vậy, tuy chỉ trong một thời gian ngắn kể từ lúc ra đời, nhiều biến dạng của PCR mới lần lượt ra đời. Chẳng hạn:

(a) RT- PCR (reverse transcriptase PCR): kỹ thuật mà RNA có thể được sử dụng làm khuôn cho sự khuyếch  đại PCR sau khi chuyển  đổi thành cDNA, còn gọi là RNA-PCR hat RT-PCR. Kỹ thuật này tỏ ra nhạy hơn các phương pháp khác được dùng cho sự phân tích RNA.

(b) RT-PCR cạnh tranh (competitive RT-PCR): kỹ thuật thường được sử dụng trong việc định lượng các loại RNA chuyên biệt.

(c) Real-Time PCR là một kỹ thuât PCR định lượng, nó có thể giúp phát hiện các sản phẩm PCR tích luỹ được tại thời điểm thực tế trong quá trình khuyếch đại gene. Nhờ vậy có thể đánh giá sự tích luỹ sản phẩm và định lượng qPCR (quantitative PCR).

(d) PCR-ELISA: sự kết hợp PCR với thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA = enzyme linked immunoassay) trong chẩn đoán.
Hình 1.12 dưới đây cho thấy một máy phân tích DNA ký hiệu iCycler

Thermal Cycler, với các tiện ích sau:
•  Cho độ chính xác cao đối với PCR định lượng thời gian thực (real-time quantitative PCR).
•  Có khả năng quay vòng chu kỳ nhiệt nhanh chóng, đun nóng ở tốc độ lên tới 3,3 °C mỗi giây và làm nguội ở tốc độ lên đến 2,0 °C mỗi giây.
•  Đảm bảo độ chính xác cao và nhiệt độ ổn định đồng bộ ...
Máy phân tích PCR

4. Các ứng dụng của PCR
Các ứng dụng cơ bản của PCR có thể kể là: nhận dạng dấu vân tay di truyền  (genetic fingerprinting), chẩn đoán bệnh di truyền, kiểm tra huyết thống, tách dòng gene (cloning),  gây  đột biến  điểm  định hướng (site-directed mutagenesis), phân tích mẩu DNA cổ, xác định allele của đột biến hoặc đa hình có ở một cá thể thông qua sử dụng PCR đặc thù cho allele (allele-specific PCR), so sánh mức độ biểu hiện của gene nhờ RT-PCR và Real-Time PCR.

Sản phẩm PCR có thể  được xác  định thông qua kích thước của nó bằng phương pháp  điện di trên bản gel agarose (agarose gel electrophoresis). Kiểu  điện di này là một quy trình bao gồm việc bơm DNA lên trên bản gel agarose và sau đó cho một dòng điện chạy qua bản gel. Kết quả là các sợi DNA bé hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các sợi lớn hơn dọc theo bản gel hướng về dòng  điện dương. Kích thước của sản phẩm PCR có thể xác định bằng cách so sánh với một thang DNA (DNA ladder), vốn có chứa các đoạn DNA có kích thước đã biết cũng nằm trong bản gel đó (Hình 1.13).
pcr


    Blogger Comment
    Facebook Comment

0 nhận xét:

Post a Comment

 
Copyright © 2013. Sinh Học Online
Distributed By My Blogger Themes | Created By ThemeXpose